微生物培養(yǎng)（microculture)是生物培養(yǎng)的中的一種。所培養(yǎng)的微生物主要有病毒、細(xì)菌、放線菌、真菌等。微生物培養(yǎng)需要用到培養(yǎng)基，根據(jù)微生物的不同種類和生活習(xí)性來(lái)配制特定的培養(yǎng)基。微生物培養(yǎng)成功的關(guān)鍵在于無(wú)菌操作，如果培養(yǎng)器具和培養(yǎng)基不能*滅菌、培養(yǎng)的過(guò)程中有雜菌污染是很容易失敗的。那么微生物培養(yǎng)步驟有哪些呢？

實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)步驟

實(shí)驗(yàn)材料

1 培養(yǎng)基和菌種

淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏I號(hào)培養(yǎng)基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基，活性污泥混合液。普通瓊脂斜面和平板,營(yíng)養(yǎng)肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。

2 溶液或試劑

10%酚液，盛9ml無(wú)菌水的試管，盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂。

3 儀器或其它用具

無(wú)菌玻璃涂棒，無(wú)菌吸管，接種環(huán)，無(wú)菌培養(yǎng)皿，鏈霉素和土樣，顯微鏡，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、涂布器等。酒精燈，玻璃鉛筆，火柴，試管架、接種環(huán)、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。

微生物培養(yǎng)步驟

1、流程

倒平板→制備梯度稀釋液→涂布（或劃線法）→培養(yǎng)→挑單菌落→保存。

2、步驟

2.1稀釋涂布平板法

2.1.1 倒平板

將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏I號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化待冷55～60℃時(shí)，高氏I號(hào)瓊脂培養(yǎng)基中加入10%酚數(shù)滴，馬丁氏培養(yǎng)中加入鏈霉素溶液(終濃度為30μg/ml)，混合均勻后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹觯嚬芑蚱靠诒３謱?duì)著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開(kāi)一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。

2.1.2 制備活性污泥混合液稀釋液

稱取土樣l0g，放入盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細(xì)胞分散。用一支lml無(wú)菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無(wú)菌水的大試管中充分混勻，然后用無(wú)菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的活性污泥混合液溶液，注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換一支試管。

2.1.3 涂布

將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號(hào)筆寫上10-4、10-5和10-6三種稀度，然后用無(wú)菌吸管分別由10-4、10-5和10-6，從三管活性污泥混合液稀釋液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在對(duì)應(yīng)平板培養(yǎng)基表面中央位置。用無(wú)菌玻璃涂棒，右手拿無(wú)菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。室溫下靜置5～l0min，使菌液浸入培養(yǎng)基。

2.1.4 培養(yǎng)

將高氏I號(hào)培養(yǎng)基平板和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒置于28℃溫室中培養(yǎng)3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)2～3d。

2.1.5 觀察并挑菌落

將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落根據(jù)其大小、顏色、形狀等特征進(jìn)行觀察，之后根據(jù)菌落不同特征分別挑取少許細(xì)胞接種到上述三種培養(yǎng)基斜面上，分別置28℃和37℃溫室培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

2.2 平板劃線分離法

2.2.1 倒平板

按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、土樣編號(hào)和實(shí)驗(yàn)日期。

2.2.2 劃線

在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10-l的活性污泥混合液懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無(wú)論采用哪種方法，其目的都是通過(guò)劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使之形成單個(gè)菌落。

用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取活性污泥混合液懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作*次平行劃線3～4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70度角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)*次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過(guò)第二次劃線部分作第三次劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。