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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC4280-50T/48S
更新時間：2024-04-15
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：861
010-50973130
產品分類
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纖維素（CLL）含量檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC4280
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
| 試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
| 提取液一 | 液體200 mL×1瓶（自備） | 2-8℃保存 |
| 提取液二 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑一 | 粉劑×2瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑二 | 液體10 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 標準品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
提取液一：80%乙醇200 mL，即將160 mL無水乙醇和40 mL蒸餾水混合，自備。提供一個125 mL空瓶。
標準品：10 mg葡萄糖。臨用前加入1 mL蒸餾水溶解，配成10 mg/mL葡萄糖溶液備用，2-8℃保存兩周。
工作液的配制：取一瓶試劑一中加入2.5 mL試劑二，充分混勻，如較難溶解，可充分震蕩或加熱攪拌；用不完的試劑可以2-8℃保存一周。
產品說明：
纖維素是由β-D-葡萄糖單元以 β-1,4-糖苷鍵連接而成的直鏈多聚體，通常與半纖維素、果膠及木質素結合在一起，是植物細胞壁的主要結構成分。以纖維素為原料的產品廣泛應用于食品、造紙、塑料、電工及科研器材等領域。
纖維素在酸性條件下加熱能分解成β-D-葡萄糖。在強酸作用條件下利用與蒽酮顯色劑測定纖維素含量。\
技術指標：
低檢出限：0.0023 mg/mL
線性范圍：0.003125-0.09 mg/mL
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、臺式低溫離心機、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰盒、B酮、濃硫酸、無水乙醇、蒸餾水和EP管。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
細胞壁物質（CWM）的提取：
稱取約0.3g（記為W1）樣本，加入1mL提取液一，室溫快速勻漿，90℃水浴20min，冷卻至室溫，6000g，25℃離心10min，棄上清。
沉淀先后用1.5mL提取液一和B酮各洗兩遍（渦旋振蕩2min左右，6000g，25℃離心10min，棄上清即可），沉淀即為粗細胞壁。
在粗細胞壁中加入1mL提取液二（去除淀粉）浸泡15小時，6000g，25℃離心10min，棄上清，將沉淀用蒸餾水清洗兩遍（渦旋振蕩2min左右，6000g，25℃離心10min，棄上清即可），之后干燥沉淀（60-100℃均可），得到細胞壁物質（CWM），稱重記為W2。
纖維素的提取：
稱取烘干的CWM約 5mg（記為W3），加入0.5mL蒸餾水充分勻漿，勻漿液轉移至EP管中，用蒸餾水定容至0.5mL。
將定容后的勻漿液置于冰水混合物中，緩慢加入0.75mL濃硫酸，緩慢混勻，冰水浴中靜置30min。8000g，4℃離心10min，取上清液，用蒸餾水稀釋20倍后待測。
注意：1. 若樣本或者干燥后的沉淀質地堅硬，可以先研碎再進行后續步驟
2. 在提取纖維素的過程中，首先，置于冰水浴中的EP管需要固定，不要上下左右浮動，一方面保障自身安全，另一方面防止冰水混合物進入EP管造成試驗誤差；再者，加入濃硫酸時，建議槍頭伸入樣本液面以下，緩慢加入，防止液面沸騰及樣本碳化。
二、測定步驟
分光光度計預熱30min以上，調節波長至620nm，蒸餾水調零。
將10mg/mL標準液用蒸餾水稀釋為0.09、0.08、0.07、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的標準溶液備用。
標準品稀釋表
| 序號 | 稀釋前濃度（mg/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（mg/mL） |
| 1 | 10 | 50 | 4950 | 0.1 |
| 2 | 0.1 | 450 | 50 | 0.09 |
| 3 | 0.1 | 400 | 100 | 0.08 |
| 4 | 0.1 | 350 | 150 | 0.07 |
| 5 | 0.1 | 500 | 500 | 0.05 |
| 6 | 0.05 | 500 | 500 | 0.025 |
| 7 | 0.025 | 500 | 500 | 0.0125 |
| 8 | 0.0125 | 500 | 500 | 0.00625 |
實驗中每個標準管需300µL標準溶液。
操作表 (在1.5mL離心管中) ：
| 試劑名稱（µL） | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
| 樣本 | 300 | - | - |
| 標準溶液 | - | 300 | - |
| 蒸餾水 | - | - | 300 |
| 工作液 | 70 | 70 | 70 |
| 濃硫酸 | 630 | 630 | 630 |
| 混勻，置95℃水浴10min（蓋緊，防止水分散失），取出后冷卻至室溫，測定620nm處吸光值A，分別記為A測定管，A標準管，A空白管。計算ΔA=A測定管-A空白管，ΔA標準=A標準管-A空白管。（空白管及標準曲線均只需檢測1-2次） |
三、纖維素含量計算
1、標準曲線的繪制：
根據標準管的濃度（x，mg/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA（y，ΔA）帶入公式計算樣本濃度（x，mg/mL）
2、纖維素含量的計算：
（1）按樣本質量計算
纖維素（mg/g 質量）=x×V提取×20×（W2÷W3）÷W1÷1.11=22.52×x×W2÷W3÷W1
（2）按樣本細胞壁物質（CWM）質量計算
纖維素（mg/g干重）=x×V提取×20÷W3÷1.11=22.52x÷W3
1.11：是此法測得葡萄糖含量換算為纖維素含量的常數，即111 µg葡萄糖用蒽酮試劑顯色相當于100µg纖維素蒽酮試劑所顯示的顏色；V提取：纖維素提取液體積，1.25mL（0.5mL蒸餾水+0.75mL濃硫酸）；20：樣本稀釋倍數；W1：樣本質量，0.3g；W2：樣本細胞壁物質（CWM）質量，g；W3，提取纖維素時稱取的細胞壁物質（CWM）質量，g。
注意事項：
如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。
濃硫酸具有強腐蝕性，操作時各個步驟均需特別注意：纖維素提取在加入濃硫酸時，建議槍頭伸入樣本液面以下，緩慢加入，以防止液體飛濺燒傷；95℃水浴結束取出后需冷卻至室溫再打開EP管蓋，以防液體飛濺燒傷。
由于試劑二揮發性強且具有刺激性氣味，建議在通風櫥中進行工作液的配制。
實驗實例：
取0.3g康乃馨葉片樣本提取細胞壁物質（CWM）0.02g，稱取烘干的CWM約 5mg（記為W3），提取纖維素，取上清液，用蒸餾水稀釋20倍后進行檢測，測得計算ΔA=A測定管-A空白管=0.821-0.051=0.77，標準曲線y=13.994+0.0072，計算x=0.0545，按樣本質量計算得：
纖維素（mg/g 質量）=22.52×x×W2÷W3÷W1=16.3645 mg/g 質量。
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