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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5260-50T/24S
更新時間：2024-04-19
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1033
010-50973130
產品分類
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丙酮酸（PA）含量檢測試劑盒（酶法）說明書
可見分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC5260
規格：50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體30mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體37μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體8 mL×1瓶 | |
標準品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前加入3.6mL蒸餾水充分溶解，分裝保存，-20℃可以保存4周，避免反復凍融；
2、 試劑三：臨用前按試劑三：蒸餾水=10μL：1mL（約13T）的比例進行稀釋，現用現配。
3、 標準品：20 μmol/mL丙酮酸鈉標準液。
產品說明：
丙酮酸通過乙酰 CoA 連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝，起著重要的樞紐作用。
在pH = 7.5 時，丙酮酸在LDH的催化作用下與NADH反應，生成NAD + 和乳酸。在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應，產生水溶性formazan。通過檢測450nm條件下吸光值，可以計算出丙酮酸含量。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液槍、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（106個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200w，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰 上待測。
1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2. 血清（漿）等其他液體：直接檢測。若有沉淀請離心后取上清待測。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30min以上，調節波長到450nm，蒸餾水調零。
2、 試劑一37℃預熱20min以上。
3、 標準品的制備：將20μmol/mL丙酮酸鈉標準液用蒸餾水稀釋得到0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μmol/mL標準溶液備用。
4、 標準品稀釋表：
序號 | 稀釋前濃度（μmol/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（μmol/mL） |
1 | 20 | 50 | 950 | 1 |
2 | 1 | 500 | 500 | 0.5 |
3 | 0.5 | 500 | 500 | 0.25 |
4 | 0.25 | 500 | 500 | 0.125 |
5 | 0.125 | 500 | 500 | 0.0625 |
6 | 0.0625 | 500 | 500 | 0.03125 |
實驗中每個標準管需100µL標準溶液。
5、 操作表：(在1.5mL EP管中加入下列試劑)
三、丙酮酸含量計算
1、標準曲線繪制：
根據標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定代入方程得到x（μmol/mL）。
2、含量計算：
（1） 按液體樣本的體積計算
丙酮酸含量（μmol/mL）=x×V樣÷V樣= x
（2） 按組織質量計算
丙酮酸含量（μmol/g 質量）= x×V樣÷(V樣÷V提×W) = x÷W
（3） 按蛋白濃度計算
丙酮酸含量（μmol/mg prot）= x×V樣÷（Cpr×V樣）= x÷Cpr
（4） 按細菌/細胞數量計算
丙酮酸含量（μmol/106 cell）= x ×V樣÷（V樣÷V提×N）= x÷N
V樣：加入的樣本體積，0.1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；V提：加入提取液的體積，1mL；W：樣本質量，g；N：細菌或細胞數量，以百萬計。
注意事項：
1. 如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者用蒸餾水稀釋樣本后再進行測定。
實驗實例：
1、 稱取約0.1g鼠肺，加入1mL提取液，冰浴研磨，8000g，4℃離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定= A空白-（A測定-A對照）=1.122-（0.678-0.299）=0.743，標曲y=1.4748x+0.0548，x=0.467µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：
丙酮酸含量（µmol/g 質量）= x×V樣 ÷(V樣÷V提×W) = x÷W =4.667µmol/g 質量。
2、 稱取約0.1g鳶尾，加入1mL提取液，冰浴研磨，8000g， 4℃離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定= A空白-（A測定-A對照）=1.122-（0.572-0.203）=0.753，標曲y=1.4748x+0.0548，x=0.473µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：
丙酮酸含量（µmol/g 質量） = x×V樣 ÷(V樣÷V提×W) = x÷W =4.73mol/g 質量。
3、 吸取0.1mL的馬血清，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定= A空白-（A測定-A對照）=1.122-（1.142-0.126）=0.106，標曲y=1.4748x+0.0548，x=0.035µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：
丙酮酸含量（μmol/mL）=x×V樣÷V樣= x =0.035 μmol/mL。
4、 收集約500萬細胞，加入1mL提取液，超聲波破碎（功率 200w，超聲3s，間隔10s，重復30次），8000g，4℃離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定= A空白-（A測定-A對照）=1.122-（0.949-0.113）=0.286，標曲y=1.4748x+0.0548，x=0.157µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：
丙酮酸含量（μmol/106 cell）= x ×V樣÷（V樣÷V提×5）=0.2 x= 0.031 μmol/106 cell。
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